Том 13 научных отчетов, номер статьи: 14167 (2023) Цитировать эту статью
19 доступов
Подробности о метриках
Микофенолата мофетил (ММФ) применяется при протеинурических заболеваниях почек, однако точный механизм его действия на подоциты пока неизвестен. Наши предыдущие эксперименты in vitro показали, что MMF может уменьшить повреждение подоцитов за счет восстановления оси Ca2+-актинового цитоскелета. Целью данного исследования было охарактеризовать биологию подоцитов во время лечения ММФ при нефротоксическом сывороточном (НТС) нефрите (НТН). NTN индуцировали у трехнедельных мышей дикого типа. На третий день половине мышей вводили ММФ (100 мг/кг массы тела/день перорально) в течение одной недели. На 10-й день мы провели протеомный анализ клубочков, а также визуализацию щелевой диафрагмы со сверхвысоким разрешением. Для многофотонной визуализации концентрации Ca2+ ([Ca2+]i) экспериментальную схему повторяли на мышах, экспрессирующих специфичный для подоцитов сенсор Ca2+. ММФ уменьшал протеинурию и образование полулуний, вызванное NTS. Мы выявили значительные изменения в количестве белков, участвующих в передаче сигналов Ca2+ и регуляции актинового цитоскелета, что было дополнительно подтверждено прямой визуализацией [Ca2+]i в подоцитах, показывающей снижение уровней Ca2+ после обработки MMF. Это было связано с тенденцией к восстановлению структуры ножки подоцитов. Здесь мы приводим доказательства того, что МПА оказывает существенное прямое влияние на подоциты. ММФ способствует улучшению [Ca2+]i и улучшению состояния дезорганизованного актинового цитоскелета в подоцитах. Эти данные расширяют знания о прямом влиянии иммунодепрессантов на подоциты, что может способствовать более эффективному лечению протеинурических гломерулопатий с наименьшими возможными побочными эффектами.
Во всем мире гломерулопатии составляют 5–14% детей с хронической болезнью почек и 15–29% детей с почечной недостаточностью1. У многих пациентов с гломерулопатиями можно поддерживать ремиссию только с помощью длительного лечения стероидами. Однако использование этого препарата в течение длительного времени приводит к серьезным побочным эффектам. Поэтому особенно педиатры изучают альтернативные стероидосберегающие варианты терапии, такие как микофенолата мофетил (ММФ), в этой уязвимой группе населения2.
ММФ, пролекарство биологически активной микофеноловой кислоты (МФК), действует как мощный обратимый ингибитор ИМФДГ, ключевого фермента биосинтеза пуринов de novo в пролиферирующих лимфоцитах, тем самым подавляя клеточно-опосредованный иммунный ответ и образование антител3. Первое исследование влияния ММФ на почки показало, что он предотвращает процесс хронического отторжения аллотрансплантата за счет снижения экспрессии молекул адгезии и цитокинов в клубочках, тем самым предотвращая гломерулосклероз4. За последние два десятилетия ММФ был разработан и широко применяется также при воспалительных гломерулопатиях5.
Помимо хорошо изученного иммуносупрессивного эффекта, мы мало знаем о том, как ММФ непосредственно действует на ткань почек, особенно на подоциты6,7. При диабетической нефропатии в группе, получавшей ММФ, наблюдались более низкая скорость апоптоза подоцитов и сохраненная экспрессия нефрина и подоцина8. Это согласуется с результатами модели с пуромицином, где ингибирование IMPDH восстанавливало пул АТФ, который сохранял экспрессию нефрина и синаптоподина и стабилизировал актиновый цитоскелет9. Кроме того, Фу и др. продемонстрировали прямое влияние ММФ на иммуноопосредованное заболевание почек: мышей MRL/lpr лечили ММФ. Впоследствии секвенирование РНК, выполненное на изолированной коре головного мозга почки, показало значительное снижение экспрессии гена Rac1, который нарушает образование физиологических стрессовых волокон при активации10. В соответствии с этим наши предыдущие эксперименты in vitro по секвенированию РНК линии подоцитов, обработанных MPA, выявили накопление терминов «актиновый цитоскелет» и «регуляция передачи сигнала, опосредованной малой ГТФазой». Кроме того, были дополнены термины «активность кальциевых каналов» и «транспорт ионов кальция»11. Повышение внутриклеточной концентрации кальция ([Ca2+]i) в подоцитах12 может привести к острой реорганизации актинового цитоскелета или даже коллапсу цитоскелета и протеинурии13,14,15,16. В настоящем исследовании мы хотели подтвердить, способен ли ММФ также уменьшать повреждение подоцитов посредством восстановления Ca2+-актиновой оси цитоскелета в in vivo модели нефротоксического сывороточного нефрита (NTN).
10 years) in our vivarium. All animal experiments were performed in accordance with relevant guidelines and regulations provided by the LANUV NRW (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen/State Agency for Nature, Environment and Consumer Protection North Rhine-Westphalia). The experimental protocol was examined and approved by the LANUV NRW (VSG81-02.04.2020.A052), which adhered to the 3R principles. Each mouse was considered as n = 1. Altogether 13 mice (5 females, 8 males) constituted the control group, 11 mice (7 females, 4 males) the NTS + veh group and 12 mice (7 females, 5 males) the NTS + MMF group. NTN was induced in three-week old mice (nephrogenesis is already completed, but they are not yet sexually mature) as follows: The animals received intraperitoneal injection of nephrotoxic serum (NTS; Probetex, San Antonio, USA) in a dose of 10 µl/g body weight (BW) on two consecutive days. From a pathogenic point of view, the historically coined term “nephrotoxic” is misleading since the serum induces an immune-mediated process. In detail, nephrotoxic antibodies (heterologous sheep antibodies raised against rat whole glomeruli) are deposited in the whole glomerulus including the subepithelial, subendothelial areas as well as mesangium. Subsequently, mesangial proliferation and crescent formation can be observed. Thus NTN serves as a model for immune-mediated glomerulopathy with proteinuria (Fig. 1a). In our study, all NTS-injected mice showed proteinuria on day 3. Mice without NTS induction served as control. Confounders were not controlled. On day 3, either water (NTS + veh) or MMF (Roche, Mannheim, Germany) in a dose of 100 mg/kgBW/d (NTS + MMF) were administered per oral gavage for seven days. They were then anesthetized with ketamine and xylazine followed by cardiac blood sampling and sacrificed by cardiac perfusion with cold phosphate-buffered saline (PBS). Depending on the further examination technique, mice were additionally perfused with 4% paraformaldehyde. The kidneys were removed and either put in melted agarose for acute kidney slices (AKS) or in 4% neutral buffered formalin for stimulated emission depletion (STED) imaging. Spot urine samples were taken before injection with NTS, on day 3 and the last day. The experimental design is depicted in Fig. 1b./p> 1.5) when comparing NTS + MMF with NTS groups. To clarify molecular functions and biological processes affected by MMF-regulated proteins, we performed Gene Ontology (GO) analyses. Figure 3 depicts a selection of significant GO terms. From the enrichment analysis, we could outline two major groups of terms that were of particular interest: Ca2+ signaling and regulation of actin cytoskeleton (Fig. 3a, b). Of the numerous identified proteins with a p value < 0.05 (Supp. Table 3), we analyzed the ones related to Ca2+ signaling and/or actin cytoskeleton regulation displayed as a heat map (Fig. 4a, b). Additionally, the distribution of the most relevant proteins for Ca2+ signaling and actin cytoskeleton regulation are shown in volcano plot (Fig. 4c). For Ca2+signaling, two proteins attracted our interest (Supp. Table 3). Wbp2, which leads to Ca2+ influx from the ER into the cytoplasm. In addition, Stim2, which is responsible for the Ca2+ influx from the extracellular into the intracellular fluid. Both were significantly down-regulated in NTS + MMF mice compared to NTS + veh group. In line with that, we detected significant changes in the expression of Ca2+-dependent proteins such as Cpne1, Cpne4, Cpne8, Fbln1, Fbln2 and Rasgrp2 (Supp. Table 3). Another group of altered proteins was involved in the regulation of the actin cytoskeleton. The protein expression level of several positive regulators for the Rac1 such as Micall2, Dock7, Trio and Fgd5 were highly down-regulated in NTS + MMF vs. NTS + veh group (Supp. Table 3). The significant reduction in the expression level of the down-stream protein Wasf2 also points in this direction (Supp. Table 3). Additionally, we found the expression level of Arhgap29, a positive regulator for RhoA, highly up-regulated (Supp. Table 3). It was in line with the increased protein level of Spn and Eif5a, which are known to promote stress fiber formation (Supp. Table 3). Finally, we observed a decreased expression level of the lamellipodia inducing Shank3 (Supp. Table 3)./p>|0.58|) altered proteins from the glomeruli proteome analysed using the ShinyGo Gene Ontology (GO) Enrichment Analysis. Panel (a) shows the comparison between NTS and control mice (NTS effect). Panel (b) shows the comparison between NTS + MMF and NTS + veh mice (therapy effect). On the left: the lollipop graphic of altered GO Molecular Functions; on the right: network analysis of the altered GO Molecular Functions. Controls n = 4; NTS + veh n = 4; NTS + MMF n = 6; NTS: nephrotoxic serum; MMF: mycophenolate mofetil./p>
Русский
English
Français
Deutsch
Español
Italiano
Português
日本語
한국어